Fijación
La fijación es un paso esencial en el procesamiento de las muestras citológicas. Una vez hecha la extensión, secaremos la muestra agitando el portaobjetos. El tiempo de secado debe ser el mínimo posible. Si se alarga demasiado produce cambios celulares artefactuales, concretamente condensación en los núcleos, lo que se traduce en una pérdida de los detalles del mismo.

La fijación alcohólica es un paso esencial en el procesamiento de las muestras.
(imagen cedida por Lamberto Viadel).

Una vez secas, las preparaciones se sumergen en una solución alcohólica (el primer líquido del DiffQuick®) durante unos segundos y se dejan secar de nuevo (no sumergir en la eosina hasta que no se hayan secado).
Los líquidos de DiffQuick® deben controlarse periódicamente. El fijador, por ejemplo, es una solución alcohólica volátil y, aunque mantenga su aspecto transparente y levemente azulado, debe oler a alcohol. Los colorantes, por su parte, van generando precipitados e impurezas con el tiempo, por lo que deben ir cambiándose periódicamente.
 
Tinción
En citología se emplean varios tipos de tinciones. Básicamente se usan tinciones dobles, también llamadas de tipo Romanowsky (Giemsa, Diff-Quick®, Hemacolor®) y las tinciones triples, de tipo Papanicolau. Debido a que la mayoría de los clínicos utilizan el DiffQuick® (tinción tipo Romanowsky) por su sencillez y rapidez, será la que describiremos. No hay una única tinción perfecta e ideal para todos los casos. Así, por ejemplo, DiffQuick® puede no teñir las granulaciones de los mastocitomas; además suele dar escasos detalles citológicos de los núcleos y nucléolos de los grupos celulares y de las células de los nódulos linfáticos. Pero su facilidad de uso la convierte en una de las tinciones más aceptables. Generalmente, conviene seguir las instrucciones del fabricante con los tiempos de tinción, pero debe tenerse en cuenta que habrá variaciones en los tiempos según el grosor de la preparación, el tipo de tejido muestreado y la edad de los colorantes.
 
Técnica DiffQuick®: generalmente se comercializa en un grupo de tres botellas de100 a 250 ml. En la clínica rellenaremos medio frasco de muestra de orina para la solución fijadora y los dos colorantes. En la tapa indicaremos con rotulador indeleble la fecha del cambio de los líquidos. Conviene cambiarlos periódicamente (cada 1 ó 2 meses, según la citología que hagamos). Los tintes viejos son motivo de artefactos y por lo tanto de errores diagnósticos. Los núcleos con un azul apagado, con pérdida de los detalles cromatínicos, nos indican que es prudente cambiar los colorantes completamente.

La técnica de tinción es la siguiente: una vez secado el portaobjetos con la muestra extendida,  dejamos la preparación unos 15 segundos en el interior del primer bote, que es el del fijador (azul claro transparente). Posteriormente se sumergen las preparaciones durante unos 5 segundos en el segundo bote (color rojo). Se saca la preparación del segundo bote, se deja escurrir el exceso de colorante sobre un papel absorbente o paño, y se baña de3 a5 segundos en el tercer bote (color azul), se escurre el exceso de colorante y acto seguido se lava suavemente con agua destilada para eliminar  el   exceso de colorante.
Se aconseja que después de utilizar un bote se cierre herméticamente antes de abrir el siguiente, evitando que se queden abiertos, con lo que se acelera el envejecimiento. Hay quien prefiere en vez de dejar la preparación dentro de los botes el tiempo requerido, meter y sacar la preparación sucesivamente durante dicho tiempo. Es cuestión de preferencias solamente. Después de lavar con agua destilada, se seca la preparación al aire, se añade una gota de medio de contraste (vaselina líquida, DPX o cualquier producto comercial para dicho fin) sobre la preparación y se coloca el cubreobjetos  encima, presionando con cuidado para que se reparta bien el líquido y no queden burbujas de aire, quedando lista para su observación al microscopio.
 
PROBLEMAS MÁS COMUNES EN LA TINCIÓN
 
 
Tinción excesivamente azul (los glóbulos rojos se ven azul-verdosos).

  • Exceso de Hematoxilina.
  • Insuficiente lavado con agua.
  • Excesivo retraso en la fijación de la muestra.
  • Agua de lavado demasiado alcalina (emplear agua destilada).
  • Exposición a vapores de formaldehído.

Tinción excesivamente rosa.

  •  Exceso de Eosina.
  • Eosina demasiado ácida (requiere cambio).

Este defecto se puede corregir en parte añadiendo más tiempo de Hematoxilina.
Coloración pálida.

  •  Colorantes demasiado viejos.
  • Fijación defectuosa.

Precipitados de los colorantes. Si los colorantes no son viejos, conviene filtrarlos además de lavar las preparaciones un poco más de tiempo.
PRINCIPALES DEFECTOS DE LAS PREPARACIONES
Excesiva celularidad.  Superposición de células que dificulta el análisis de las agrupaciones, las cuales se ven opacas y oscuras, sin detalle. Se debe utilizar una aguja más fina o practicar extensiones más finas.
Excesiva dilución celular.  Pocas células o ausencia de éstas. Habría que centrifugar los líquidos y examinar el sedimento. Si es una masa, utilizar una aguja de mayor calibre o, si se puede, realizar la técnica del raspado.
Contaminación sanguínea.  Debida a una aspiración excesiva o bien a improntas donde no se ha realizado un buen secado de la superficie del órgano. Hay lesiones u órganos que por su naturaleza generan mayor cantidad de contaminación sanguínea, lo que conlleva una dilución de las células tisulares y la obtención de muestras no diagnósticas.
 Presión excesiva.  Si a la hora de realizar el frotis se aplica excesiva presión se produce la lisis celular vertiéndose el contenido nuclear y citoplasmático por la preparación y quedando muchos núcleos libres aislados (“núcleos desnudos”).  Hay que repetir la muestra. Es un artefacto muy habitual en punciones de ganglio linfático u órganos linfoides en general, por tratarse de una célula muy frágil.
 

Artefacto mecánico por exceso de presión de arrastre en una extensión (punción de ganglio linfático). Se aprecia destrucción de núcleos y dispersión del contenido nuclear en la dirección de arrastre.
Imagen cedida por Lamberto Viadel.

Secado defectuoso. Produce falta de nitidez del núcleo y citoplasma (células pálidas con contorno espectral citoplasmático). El secado se hará por agitación o con secador (sin acercarlo demasiado) tan pronto como sea posible.
 
Fijación inadecuada. Generalmente debida a un retraso excesivo en la fijación, produciéndose artefactos por cambios degenerativos (vacuolización citoplasmática, retracción de núcleos). Genera, además, una pérdida de nitidez.
 
Coloración inadecuada. Por defecto: se observan núcleos pálidos. Se puede volver a pasar el portaobjetos por el tercer bote del Diff-Quik®. Habría que realizar preparaciones más finas.
Por exceso: la tinción excesiva no deja estudiar los detalles celulares. Volver a teñir otra muestra rebajando los tiempos de tinción.
EXAMEN MICROSCÓPICO
Una vez la preparación esté lista para examinar conviene seguir una serie de pautas fijas:
1.- Evaluación global: valoramos la o las preparaciones con el objetivo de 4x, barriendo toda la laminilla de un extremo a otro:
En este primer paso determinamos la calidad tintorial de la preparación, la cantidad de célula obtenida, localizamos zonas “buenas” y zonas “malas” y hacemos una selección para pasar a la siguiente fase.
 
2.- Interpretación: una vez escogidas algunas áreas las valoramos con el objetivo de 10x. Determinamos inicialmente si se trata de célula inflamatoria o parenquimatosa e identificamos el tipo o los tipos celulares implicados. Para el detalle fino podemos emplear los 40x aumentos. El objetivo de 100x (inmersión oleosa) se emplea poco en citología, principalmente para la identificación de elementos parasitarios.
En caso de tratarse de una neoplasia, hay que intentar mediante la forma de las células y la asociación entre éstas,  identificar el tipo tumoral (epiteliales, mesenquimatosas o de células redondas). Posteriormente, lo ideal es determinar si se trata de una neoplasia benigna o maligna, bien porque se reconoce directamente al tumor o aplicando los criterios de malignidad.
Un mal hábito frecuente es emplear solamente con un objetivo, con lo que perderemos información. Si examinamos únicamente con el objetivo de 10x, muchas estructuras no se apreciarán al pasar totalmente desapercibidas; si miramos sólo con el de 40x ó 100x, el campo de visión es tan pequeño con respecto a la preparación que podemos estar valorando una zona no representativa o simplemente una zona no afectada. Si se pretende pasar al objetivo  de inmersión 100x, ha de ser preferentemente al final del examen,  ya que el aceite sobre el «cubre» nos imposibilita utilizar de nuevo el objetivo de 40x en esa zona y en este caso tendremos que limpiarlo.
 
CONSEJOS PRÁCTICOS

  •  Disponer de un buen microscopio y de uno o más atlas de citología. En general hoy en día las ópticas de los principales fabricantes son lo suficientemente buenas como para que un microscopio básico, de tipo “prácticas” pueda ser suficiente. Si se va a emplear asiduamente, sin embargo, es más recomendable un microscopio de gama media, más ergonómico, más luminoso y más cómodo para trabajar.
  • Aunque es una técnica rápida  requiere un examen meticuloso y sistemático, ¡no tener prisa en buscar una característica citológica que nos lleve  al diagnóstico lo antes posible!
  • Guardar debidamente las preparaciones para que no se deterioren por el polvo o suciedad.

Es importante mantener un archivo ordenado de los diferentes casos, con una correcta identificación de los portaobjetos, indicando número de historia clínica, fecha, nombre de paciente y diagnóstico.
Imagen cedida por Lamberto Viadel.

 

  • Cerrar  cada bote de la tinción  inmediatamente después de su utilización.
  • Se recomienda tener dos juegos de tinciones, uno «limpio» para uso general y  otro «sucio» para  citología fecal y cualquier muestra que pueda desprender materia a los botes de tinción.
  • Utilizar siempre cubreobjetos,  se gana en nitidez de imagen.
  • Utilizar siempre portaobjetos de excelente calidad, ¡nunca utilizar portaobjetos «reciclados»! Además es aconsejable limpiar con un pañuelo de papel los portaobjetos para eliminar cualquier resto de polvo o suciedad.
  • Realizar varias extensiones por caso clínico, por ejemplo tres  y dejar otras sin teñir pero fijadas,  por si se han de mandar al laboratorio y necesitaran tinciones especiales.
  • Identificar debidamente cada portaobjetos con el nombre del paciente, caso clínico y órgano a que corresponda.
  • No tocar la superficie dela extensión. Sorprende la cantidad de queratina que puede dejar un dedo puesto sobre la preparación.
  • Utilizar siempre el mismo sistema de fijación o tinción, ya que los patrones de cromatina y la observación de las membranas varían y nos puede llevar a errores diagnósticos.
  • En caso de biopsias, no realizar las AAF o las improntas cerca del frasco de la formalina, ya que sus vapores provocan graves alteraciones en las características tintoriales y morfológicas de las muestras, ¡ni siquiera abrir el bote de formalina en la sala o habitación antes de realizar las preparaciones citológicas!
  • Apuntar sobre las tapas de los botes de tinción, la fecha en la que se cambiaron. Dependiendo de las citologías que hagamos es prudente cambiar los colorantes periódicamente cada 1 ó 2 meses.
  • Se recambian los botes de tinción completamente para evitar agentes contaminantes infecciosos o elementos celulares sobrenadantes que  se adhieran a la preparación   actuando como artefactos.